Antivirový efekt proti viru Zika jsme objevili jako první na světě

Cílem projektu „Pokročilé studie patogeneze západonilské virové horečky směřující k novým terapeutickým strategiím“ byl návrh, syntéza a testování nových nukleotidových a nukleosidových analogů proti viru západonilské horečky a dalším flavivirům (virus Zika, virus klíšťové encefalitidy…) a ověření jejich účinku v kombinaci s imunomodulačními látkami. Projekt má význam pro terapii závažných infekčních onemocnění i pro edukaci pre a postgraduálních studentů. Vynikající výsledky projektu byly publikovány v 18 článcích s impakt faktorem. O detailech jsme si povídali s docentem Danielem Růžkem z Výzkumného ústavu veterinárního lékařství.

Proč jste se rozhodl věnovat v projektu právě tomuto tématu?

Flaviviry jsou patogeny globálního významu – mnohé z nich jsou přenášené bezobratlými přenašeči (komáry či klíšťaty) a způsobují každoročně stovky milionů lidských infekcí. Kromě Antarktidy se flaviviry vyskytují na všech kontinentech. U člověka způsobují široké spektrum klinicky manifestních onemocnění – od mírných horečnatých nákaz až po závažné a život ohrožující encefalitidy či encefalomyelitidy. Infekce některými flaviviry má teratogenní účinky, jiné jsou například původci krvácivých (hemoragických) horeček. Proti několika flavivirovým nákazám existuje možnost účinné vakcinace, proti žádnému flaviviru ale nebyla doposud schválená účinná terapie. Výzkum flavivirů a zejména možností protiflavivirové terapie tak představuje globální prioritu.

Náš projekt byl primárně zaměřen na studium flaviviru západonilské horečky (West Nile virus) a vývoj a testování specifických antivirotik (virostatik) účinných proti tomuto viru. Virus západonilské horečky původně cirkuloval pouze v Africe, dnes však můžeme hovořit o jeho kosmopolitním výskytu. Virus se může brzy stát zdravotní hrozbou i v České republice – například v roce 2018 byl v ČR zaznamenán první případ úmrtí pacienta, který se nakazil virem západonilské horečky na území Jihomoravského kraje. V rámci projektu jsme se ale zaměřili i na další flaviviry, které mají značný medicínský význam. V roce 2015 se začal dramaticky šířit zejména v oblastech Střední a Jižní Ameriky flavivirus Zika. Zjistilo se, že infekce tímto virem může u těhotných žen závažným způsobem poškodit vývoj plodu a způsobit mimo jiné tzv. mikrocefalii.

To samozřejmě byla pro nás výzva, která nakonec byla korunovaná úspěchem – jako první na světě jsme prakticky ve stejný okamžik jako belgičtí vědci popsali vůbec první účinné nízkomolární látky, které vykazovaly vysoký inhibiční účinek proti tomuto viru. Tento objev tehdy stal mediální senzací a setkal se s velkým zájmem i v odborných kruzích. Kromě viru západonilské horečky a viru Zika jsme se v rámci našeho projektu zaměřili, byť okrajově, i na další flavivirus, virus klíšťové encefalitidy. Ten je nosným předmětem výzkumu naší laboratoře a představuje dlouhodobý problém nejen v ČR, ale i řadě dalších zemí euroasijského kontinentu. Naším cílem tedy bylo přispět jednak k poznání mechanismů, které jsou zapojeny při vzniku těchto onemocnění, a především identifikovat látky s antivirovým účinkem, které by měly potenciál být v budoucnu využity jako léky na tyto infekce.

Pracovníci zapojení do projektu, RNDr. Martin Palus, Ph.D., a Mgr. Václav Hönig, Ph.D., při práci ve virologické laboratoři s vysokým stupněm biologického zabezpečení. Foto: Biologické centrum AVČR.

Můžete laikovi přiblížit, co přesně jste v projektu zkoumali/chtěli zjistit?

Projekt měl dvě základní roviny. V první části jsme zkoumali mechanismy patogeneze západonilské horečky a dalších vybraných flavivirových nákaz, tedy to, jakým způsobem se virus šíří v organismu, kde se lokalizuje, jaké buňky preferenčně napadá a jaké tkáně a orgány narušuje. Druhá rovina se týkala přímo vývoje a testování antivirových látek účinných proti viru západonilské horečky a dalším flavivirům. V rámci první části jsme také vytvořili vhodné laboratorní modely flavivirové infekce, ať už založené na buněčných kulturách či laboratorních zvířatech, které pak byly následně využity při testování potenciálních antivirotik a charakterizace jejich mechanismu účinku. Cílem projektu tak bylo pochopení procesů, ke kterým dochází v organismu napadeném virovou infekcí, a identifikace látek, které mají antivirový účinek, a tedy potenciál být využity jako protivirové léky.

Jak a kde projekt konkrétně probíhal, jaké metody jste použili?

Vzhledem k náročnosti projektu jej bylo nutné realizovat na třech spoluřešitelských pracovištích – v Laboratoři emergentních virových nákaz, která je společným pracovištěm Výzkumného ústavu veterinárního lékařství v Brně a Parazitologického ústavu Biologického centra AVČR v Českých Budějovicích, a dále v Ústavu biologie obratlovců AVČR ve Valticích (prof. RNDr. Zdeněk Hubálek, DrSc., doc. RNDr. Ivo Rudolf, Ph.D.) a v Ústavu organické chemie a biochemie AVČR v Praze (Mgr. Radim Nencka, Ph.D.). Jednalo se tedy o společné úsilí virologů, odborníků v oblasti medicínské zoologie a medicinálních chemiků. Většina práce se tedy odehrávala převážně v laboratořích organické chemie (syntéza látek) a ve virologických laboratořích.

Vzhledem k tomu, že virus západonilské horečky je nebezpečným patogenem člověka, veškerá práce se životaschopným virem se musí odehrávat v laboratořích s vysokým stupněm biologického zabezpečení (BSL-3). Jedná se o laboratoře s omezeným přístupem, ve kterých je udržován podtlak vzduchu a odsávaný vzduch je filtrován speciálními HePa filtry, které mají póry tam malé, že dokáží zachytit i virové částice. Pracovníci nosí v laboratoři speciální jednorázové obleky a přes hlavu mají kuklu s přívodem vzduchu. Částečně výzkum probíhal i v terénu, kde se kolegové z Ústavu biologie obratlovců věnovali monitoringu výskytu viru západonilské horečky v komárech a izolovali zajímavé nové kmeny viru lišící se svými biologickými vlastnostmi, které byly následně využity v experimentech zaměřených na patogenezi onemocnění a též při testování antivirových látek. Samotné experimenty byly prováděny na buněčných kulturách a s využitím laboratorních myší. Kvůli komplexnosti problematiky není možné veškeré testy na laboratorních zvířatech nahradit alternativními metodami.

V případě testování antivirových látek byly provedeny počáteční pokusy na buňkách a pouze takové látky, které v těchto podmínkách vykazovaly nejlepší antivirový účinek a nejnižší toxicitu, byly následně vybrány pro testování na myších. Pomocí těchto experimentů jsme nakonec identifikovali látku, která vykazovala vysoký léčebný efekt, kdy v případě podání látky přežívalo 90-100 % jedinců infikovaných smrtelnou dávkou viru. Látka kromě toho měla schopnost potlačit množení viru v těle infikovaného organismu a mírnila neurologické příznaky.

RNDr. Martin Palus, Ph.D. při práci ve virologické laboratoři s vysokým stupněm biologického zabezpečení. Foto: Biologické centrum AVČR.

Co bylo v projektu nejtěžší?

Problematika vývoje a testování antivirových látek je mimořádně kompetitivní. Existuje celá řada konkurenčních skupin, které se věnují podobné problematice a mnohdy jde doslova o závod, kdo s daným objevem přijde jako první. Již nejednou se nám stalo, že s tématem, kterému jsme se intenzivně věnovali a které jsme již finišovali, nás předběhla konkurenční skupina. Na druhou stranu vím, jsme zase již několikrát předběhli my je, a to se mnohdy jedná o týmy s lepším zázemím a neporovnatelně většími finančními prostředky na výzkum. Když vypukla epidemie viru Zika, jednalo se doslova o závod. Tehdy nebylo ani jednoduché virus pro pokusy získat, protože virové sbírky byly naprosto zahlceny požadavky z celého světa.

Nám se podařilo virus nakonec získat od spřátelené laboratoře v zahraničí a ihned jsme zahájili testování přednostně látek, u kterých jsme již věděli, že účinkují proti viru západonilské horečky a viru klíšťové encefalitidy – předpokládali jsme, že podobný efekt bude pozorován i proti viru Zika. Znamenalo to pro nás dlouhé večery a víkendy strávené v laboratoři, ale tato strategie se ukázala být správnou. Nakonec jsme své výsledky publikovali jako první na světě, prakticky ve stejný okamžik jako belgická skupina, která identifikovala antivirový efekt proti viru Zika u zcela identické molekuly.

Jak je možné zjištěné informace využít v praxi?

Ne každá látka, která má antivirový účinek, se nakonec stane lékem. V každém případě i pouhý popis antivirového účinku u konkrétní molekuly má svůj smysl. Na základě takového zjištění totiž mohou chemici syntetizovat příbuzné molekuly, mohou se testovat různé možnosti kombinační terapie a podobně. Každé takové zjištění tak otvírá další, dříve netušené možnosti. V našem případě však přesto známe jednu látku, která již má k použití u pacientů relativně blízko. Jedná se o látku, která je v tuto chvíli ve druhé fázi klinického testování u lidských pacientů infikovaných virem žluté zimnice. Naše laboratoř objevila, že tato látka účinkuje i proti viru západonilské horečky, viru Zika a viru klíšťové encefalitidy. Pokud tedy bude nakonec schválená pro terapii žluté zimnice, již bude jen krůček k jejímu použití i pro tyto další flavivirové nákazy. Nezbývá než doufat, že veškeré testy dopadnou dobře.

Daniel Růžek

Na čem aktuálně pracujete a jaké jsou vaše plány?

Vývoj a testování potenciálních antivirotik aktivních proti flavivirům i nadále pokračuje. Věnujeme se především viru klíšťové encefalitidy. Problematikou klíšťové encefalitidy se zabýváme i z hlediska poznání patogeneze onemocnění – zajímá nás, jakým způsobem virus proniká do mozku hostitele, jaké konkrétní buněčné typy v mozku virus napadá, jak probíhá imunitní odezva v infikovaném mozku a v periferních tkáních. Snažíme se také nalézt konkrétní geny v genomu pacienta, které předurčují závažnost klinického průběhu klíšťové encefalitidy. Kromě toho pracujeme i na vývoji účinné imunoterapie či post-expoziční profylaxe klíšťové encefalitidy, založené na použití lidských monoklonálních protilátek. V takovém případě by bylo možné aplikovat imunoglobulinový preparát již po odstranění přisátého klíštěte – podání protilátek by pak snížilo riziko rozvoje onemocnění. V tomto směru je náš výzkum ale stále ještě v plenkách.

Jak jste spokojen se systémem GRIS a s ním spojenou administrativou?

Velmi oceňuji snahu Grantové agentury ČR snížit administrativní zátěž spjatou s řešením projektů. Má dosavadní zkušenost se spoluprací s GA ČR je zcela pozitivní. Systém GRIS je uživatelsky přátelský a jednoduchý.