Začátkem léta se v lesích a údolích objevují svatojánské mušky – světlušky (Lamprohiza splendidula). Jejich těla vydávají zelené světlo, kterému říkáme luminiscence. Trochu odborněji bychom mohli říci, že světlušky mají luminiscenční značky. I když jejich světlo je slabé, velmi dobře je vidíme. To je způsobeno okolní tmou, kdy nás neruší žádné jiné záření, tedy není přítomno rušivé pozadí. Stejný princip můžeme použít i při pozorování tak nepatrných objektů, jako jsou molekuly. Právě na něj se ve svém projektu podpořeném GA ČR, který byl hodnocen jako vynikající, zaměřil tým Antonína Hlaváčka z Ústavu analytické chemie AV ČR.
Fluorofory – klasické značky
Některé molekuly – fluorofory – také mohou vydávat luminiscenci, kterou nazýváme fluorescence. Luminiscence molekuly jednoho fluoroforu je velmi slabá, ale při nízkém pozadí je dostatečná dokonce i pro pozorování v optických mikroskopech. Fluorofor můžeme použít jako luminiscenční značku pro molekuly, kterým vlastnost luminiscence chybí. Tímto označováním si vybíráme, které molekuly můžeme pozorovat a které zůstanou skryté. Fluorofory jsou proto velmi významné a v řadě případů umožňují získat vynikající výsledky. Fluorescenci však vykazují i látky, které se běžně vyskytují v živých organismech a přírodních materiálech. Tyto přirozené fluorofory potom zvyšují pozadí a brání úspěšnému experimentu – je to jako bychom hledali svatojánské mušky se svítilnou na čele!
Foton-upkonverzní nanočástice – nová generace značek
Řešením tohoto problému se zabývá i Antonín Hlaváček. Jeho pozornost upoutaly především nanočástice, které vykazují zvláštní typ luminiscence – fotonovou upkonverzi. Fotonová upkonverze je zvláštní jev, kdy nanočástice absorbují neviditelné infračervené záření a vyzařují ho v podobě viditelného světla různých barev. Foton-upkonverzní nanočástice jsou velmi malé krystaly s velikostí přibližně 5-100 nm. „Díky obsahu vybraných lanthanoidů mají schopnost postupně absorbovat několik fotonů s nízkou energií – neviditelné infračervené záření. Nanočástice tak získá dostatek energie pro vyzáření fotonů viditelného světla,“ vysvětluje Antonín Hlaváček.
Luminiscence disperzí různých foton-upkonverzních nanočástic vyvolaná tenkým paprskem neviditelného infračerveného laseru (zleva emise iontů europitých, thulitých, erbitých).
Využití foton-upkonverzních nanočástic
Velikost některých molekul, jako jsou proteiny, je s velikostí foton-upkonverzních nanočástic srovnatelná, a tak je možné je použít k jejich značkování. Jestliže foton-upkonverzními nanočásticemi označíme molekuly, můžeme je pozorovat a neruší nás žádné jiné zdroje záření na pozadí – jsou jako světlušky za bezměsíčné noci. Díky nízkému pozadí mohou být takto označené molekuly pozorovány dokonce jednotlivě, a to i s poměrně nenáročnou instrumentací. Tímto způsobem označené molekuly se uplatňují například v imunohistochemii, která umožňuje studium mikroskopické struktury živočišných tkání a rostlinných pletiv. Imunohistochemie umožňuje v mikroskopických preparátech specificky označit vybrané molekuly a pozorovat jejich prostorové rozložení. Podobně můžeme měřit i koncentraci molekul v imunochemických detekčních metodách. V tomto případě měříme intenzitu fotonové upkonverze označených molekul, ze které můžeme určit koncentraci stanovované látky.
Kromě zeleně zářících světlušek existují i další světélkující organismy, které vyzařující světlo různých barev. Něčeho podobného se Antonín Hlaváček pokouší dosáhnout ve světě nanočástic a molekul. Zabývá se vývojem foton-upkonvezních nanočástic, které mohou vydávat záření různých barev. Jedná se o takzvané multiplexování, které umožňuje současně pozorovat několik typů molekul.
Optická mikroskopie modrých a zelených foton-upkonverzní nanočástic adsorbovaných na skleněném substrátu. Velikost nanočástic je přibližně 25 nm.
V současné době Antonín Hlaváček využívá multiplexování v mikrofluidních experimentech, kdy s jeho pomocí může označovat (kódovat) mikrokapkové reaktory. To umožňuje provádět velké množství například biochemických experimentů a vyhodnocovat jejich výsledky během zlomků vteřiny. V navazujícím projektu ve spolupráci s Ústavem biochemie Masarykovy univerzity v Brně vyvíjí nové imunochemické metody. S využitím multiplexování s foton-upkonverzními nanočásticemi a automatizace na mikrofluidních čipech může být zlepšena detekce klinicky významných proteinových markerů. „V těchto experimentech je důležité detekovat minimální množství cílových molekul. Proto možnost pozorovaní a počítání jednotlivých molekul nachází skvělé uplatnění“, zamýšlí se doktor Hlaváček závěrem.
Experti fotonové upkonverze na Ústavu analytické chemie AV ČR (zleva Julie Weisová, Antonín Hlaváček a Jana Křivánková). Antonín Hlaváček vystudoval obor biochemie na Přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity v Brně. V současnosti se věnuje přípravě nanočástic a vývoji instrumentace pro analytickou chemii. Antonín Hlaváček si velmi váží podpory GA ČR, výborného prostředí na Ústavu analytické chemie AV ČR a vynikajících kolegů, bez kterých by výzkum nebyl možný.
Autor textu: Ústav analytické chemie AV ČR