Projekt má mimořádný přínos nejen pro oblast epigenetiky rostlin. Výsledky přesahují rovněž do oblasti humánní epigenetiky a klinické medicíny. Mimořádnou kvalitu výsledků projektu dokumentuje také skutečnost, že ze 14 publikací v časopisech s IF je 11 v 1. kvartilu příslušné kategorie, z toho pak 5 v 1. decilu. Taková je stručná charakteristika projektu Grantové agentury ČR Faktory genomové stability u mechu a vyšších rostlin. O detailech projektu jsme si povídali s jeho řešiteli prof. RNDr. Jiřím Fajkusem, CSc., z Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity a RNDr. Karlem Angelisem, CSc., z Ústavu experimentální botaniky AV ČR.
Můžete popsat, co bylo hlavním cílem projektu, který jste společně řešili?
Karel Angelis (KA): Faktory znamenají v našem případě enzymy, podpůrné proteiny a mechanismy opravy DNA, které zajišťují „mechanickou“ neporušenost – stabilitu genomové DNA tak, aby mohla sloužit jako templát pro svoji replikaci a průchod buněčným cyklem.
Jiří Fajkus (JF): K poškození DNA dochází z řady různých vnějších i vnitřních příčin. Mezi nejrizikovější fyziologické procesy patří v tomto směru právě kopírování genetické informace, tedy replikace. Pro každý organismus, ať už jde o člověka nebo rostlinu, je důležité zachování jeho genetické informace bez potenciálně škodlivých mutací a ztrát. Opravu poškození genomu – tedy poškozené DNA v chromozomech – má v buňkách na starosti hned několik biochemických drah, tvořených zmíněnými faktory, které zajišťují rozpoznání poškození a jeho následnou opravu.
KA: Pro laika, jde o obdobu přetrženého magnetofonového pásku, který znovu slepíme tak, že ho lze znovu přehrát a v místě původního poškození můžeme slyšet nějaké to zapraskání.
JF: Ke ztrátě části genetické informace však může docházet také v důsledku neúplného kopírování konců chromozomů, tzv. telomer. Následné zkracování chromozomů může kompenzovat enzymový komplex zvaný telomeráza. Naopak činnost zmíněných opravných systémů je na telomerách blokována specifickými bílkovinami, aby nebyly přirozené konce chromozomů mylně pokládány za neopravené chromozomální zlomy. V projektu nám tedy šlo o objasnění vzájemných vztahů mezi opravnými mechanismy a regulací údržby telomer. Věnovali jsme se také úloze sestavování chromatinu ve stabilitě chromozomů, protože DNA ve všech základních fyziologických procesech, kam patří replikace, transkripce a rekombinace, nevystupuje jako čistá nukleová kyselina, nýbrž jako supramolekulární komplex s histony a dalšími makromolekulami – tedy to, čemu říkáme chromatin.
Mech je pro kometový test ideální I.
Proč jste se rozhodli v projektu zkoumat právě toto téma?
JF: Protože jde o téma závažné z hlediska zachování životaschopnosti buněk a organismů. Téma úzce spojené s problematikou stárnutí a patogeneze závažných onemocnění. Dále proto, že v uvedené problematice mají oba výzkumné týmy, zúčastněné na projektu, prokazatelnou expertízu. Zkušenosti a orientace v dané problematice umožňují nejen zacílit výzkum na skutečně aktuální otázky, ale je to také významné hledisko při posuzování, zda je projekt vhodný k financování
Jak projekt probíhal? Jaké metody jste použili?
KA: Pracovali jsme v laboratořích a v kancelářích na počítačích. Rostliny – v našem případě huseníček (Arabidopsis thaliana) a mech (Physcomitrella patens) pěstujeme v růstových komorách za přesně kontrolovaných podmínek. Specifikem naší laboratoře je detekce přímého poškození DNA oproti většinovému studiu doprovodných dějů, které jsou snáze měřitelné. V posledních letech výlučně používáme tzv. kometový test, pro který je po metodické stránce mech (Physcomitrella patens) téměř ideální objekt.
JF: V naší části projektu jsme používali metody stanovení aktivity a exprese telomerázy, měření délky telomer nebo třeba stanovení počtu kopií genů pro ribozomální RNA (rDNA), a to jednak pomocí kvantitativní polymerázová řetězová reakce, jednak analýzou genomických dat. Používali jsme ale také např. fluorescenční mikroskopii, která umožnila potvrdit a vizualizovat tzv. vázané uspořádání 5S a 45S rDNA lokusů.
Obrázek standardních a mutantních rostlin Arabidopsis thaliana v květináčcích
Překvapilo Vás něco v průběhu projektu? Bylo tam něco, co jste nečekali?
KA: To by bylo špatné. Profesor B. Strauss, u kterého jsem byl na postdoktoranském pobytu na Chicagské universitě, vždy říkal „nemám rád neočekávané výsledky, neboť to ukazuje, že pokus nebyl náležitě promyšlen“. A tímto doporučením se snažím řídit. Na základě předchozích zjištění se výsledky, byť nové, daly předvídat.
JF: Pracovní hypotézy a experimenty by měly být nastaveny tak, aby potvrdily nebo vyvrátily předvídatelné varianty možných řešení. Překvapení ale mohou být různého typu. Obecně vzato, není dobré, když vás během řešení projektu „překvapí“, že dosud fungující metoda fungovat přestala a vy nevíte proč, i když i to se stává. Naštěstí se ale konala i jiná překvapení. Je třeba říci, že pokud by se výsledky daly předem dobře odhadnout, nebyla by ta práce ani zajímavá a je otázkou, zda by ji mělo smysl financovat jako základní výzkum. Je pochopitelné, že dobrý odhad možných variant výsledku umožní lépe navrhnout pokus a ušetřit čas i peníze. Ale v základním výzkumu jsou překvapení spíše pravidlem a každopádně významnou motivací pro lidi, kteří se mu věnují.
Jaká konkrétní „překvapení“ byla v rámci vašeho projektu?
JF: Ukázalo se například, že ztráta funkce proteinu RTEL1, který je důležitým negativním regulátorem oprav prostřednictvím tzv. homologní rekombinace a umí odstraňovat různé neobvyklé struktury na DNA, má pro údržbu telomer velmi podobné důsledky u mechu jako u člověka, kde způsobuje velmi závažné vrozené onemocnění. Tento projev je ale velmi odlišný od toho, co bylo pozorováno u nejznámější modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Jinak řečeno, dvě modelové rostliny se v tomto ohledu liší víc, než mech a člověk. Takže tohle trochu překvapivé zjištění jen znovu ukazuje, proč je nezbytné pracovat paralelně na více modelových systémech, pokud chceme výsledky zobecňovat. Nebo jiný příklad: v rámci studia sestavování funkčního komplexu rostlinné telomerázy jsme zjistili, že se tohoto procesu v Arabidopsis účastní podobné proteiny jako u člověka – rostlinné homology proteinů pontin a reptin. Jejich interakce s telomerázou však nejsou na rozdíl od situace u člověka a dalších savců přímé, nýbrž jsou zprostředkovány tzv. TRB proteiny, které jinde než u rostlin nebyly nalezeny. Proces sestavování telomerázy u rostlin je tedy odlišný a jinak regulovaný, ačkoli většina zúčastněných „hráčů“ je stejná.
Mech je pro kometový test ideální II.
Jak dlouho jste na projektu pracovali a kolik lidí se na něm podílelo?
JF: Projekt trval jakožto standardní projekt GA ČR tři roky. Je ale třeba současně dodat, že vstupní poznatky a rostlinný materiál, zejména některé mutantní linie mechu a Arabidopsis, jsme měli k dispozici již z předchozího projektu GA ČR, který jsme řešili rovněž ve spolupráci s týmem Karla Angelise. Specifikovat počty zúčastněných lidí není úplně snadné, i když formálně to lze vyčíst z každoročních zpráv o řešení projektu s přesností na desetiny úvazku. V našem týmu šlo průběžně o 6 pracovníků s pracovní kapacitou 0,2-0,7 úvazku, a v týmu K. Angelise o 4 osoby. Projektu se účastnili ve značné míře také studenti a stážující postdoktorandi. Tím pádem se během tří let trvání postupně měnilo i složení týmů, zejména v týmu z Masarykovy univerzity.
V čem pro vás byla hlavní výzva? Co jste, abyste se dopracovali k cíli, museli překonat?
KA: V některých chvílích bylo největší výzvou zbavit se kontaminace a rozpěstovat nové kultury mechu.
JF: O překvapeních, kdy nějaká metoda přestane fungovat, už tu byla řeč. V našem případě se to stalo u obyčejné polymerázové řetězové reakce, pomocí které jsme chtěli získat mezerník mezi kódujícími oblastmi pro 5S rDNA a 45S rDNA u mechu. Nakonec se to s nějakými přísadami jakžtakž povedlo. Následně se ukázalo, že potíže pramenily z toho, že v mezerníku je oblast tvorby velmi stabilních čtyř- řetězcových struktur DNA, které možná působí jako regulační faktor. Tyto tzv. G4 struktury umí totiž zmíněný protein RTEL1 rozplétat, a když k tomu nedojde, zablokují kopírování nebo přepis DNA. Jsou tedy i pravděpodobnou příčinou ztrát části kopií rDNA, kterou jsme u příslušných mutantů pozorovali. Takže ty problémy se nakonec ukázaly jako docela užitečné pro pochopení našeho problému.
Jak mohou být získané informace využity v praxi? Můžete uvést nějaké konkrétní příklady, které by to přiblížily laikovi?
JF: Projekt přinesl řadu nových informací o funkci bílkovin RAD51 a RTEL1, o sestavování komplexu telomerázy nebo o významu komplexu CAF1 (Chromatin Assembly Factor-1), který nově syntetizovanou DNA sbaluje s komplexy bílkovin zvaných histony do struktury chromatinu. To všechno jsou faktory, které najdeme napříč všemi říšemi organismů, včetně člověka, a které hrají významnou úlohu v udržování stability jejich genomů. Vyvážená funkce těchto faktorů je nezbytná pro normální život a růst organismů, naopak jejich poruchy vedou k hromadění poškození genomu, které vedou např. u člověka ke vzniku závažných onemocnění a jsou i jednou z příčin stárnutí. Jako projekt základního výzkumu neměl náš projekt za cíl přímou aplikaci těchto poznatků. Je však zřejmé, že lepší znalost významu a funkce těchto faktorů umožňuje zabývat se např. vývojem potenciálních léčiv, která činnost těchto faktorů podpoří v normálních buňkách, zatímco inhibice jejich funkce třeba v buňkách nádorových naopak usnadní jejich usmrcení. Nebo lze uvažovat o vývoji odrůd zemědělských plodin lépe vybavených proti mutagenním vlivům prostředí, a ty pak budou díky zvýšené ochraně genomu proti poškození životaschopné i za stresových podmínek.
Rostlinky Arabidopsis na Petriho misce
Podařilo se v projektu naplnit cíle, které jste si stanovili?
JF/KA: Ano.
Jakou roli v projektu hrál GA ČR?
KA: Zásadní, instituce standardních grantů je stimulujícím prvkem studia dílčích témat, který z podstaty brání tomu, aby se řešitel stal pasivní. Podporuje tvůrčí, manažérskou i finanční zdatnost navrhovatele/spolunavrhovatele.
JF: Kromě toho, že role GA ČR je, zejména vzhledem k velmi nízkému institucionálnímu financování výzkumu v ČR, pro základní výzkum naprosto zásadní, velmi oceňuji, že se GA ČR poměrně úspěšně brání tendencím k nadměrné byrokratizaci. V posledních několika letech se dokonce daří odstraňovat některé dříve zavedené administrativní komplikace a omezení, takže příprava projektu a jeho management představují v porovnání s ostatními projektovými schématy únosné břemeno jak pro vědce, tak pro jejich instituce.