Rostlinná bioložka Martina Dvořáčková ze Středoevropského výzkumného institutu CEITEC studuje opravy DNA. Na mutovaných rostlinách se snaží popsat molekulárně-biologické mechanizmy, které se podílejí na nápravě poškozených úseků. V loňském roce za svůj projekt získala čestné uznání předsedy Grantové agentury České republiky (GA ČR).
Aby buňky ve svém nitru udržely pořádek, tak využívají různá „úložná řešení“. Jedním z nich jsou organizační proteiny zvané histony, kolem kterých je navinuta DNA. Takto omotaná nukleová kyselina je ještě složená do struktury, které říkáme chromatin. Dojde-li v buněčném jádře k poškození DNA, tak se chromatin reorganizuje a díky jeho rozvolnění se mohou opravné proteiny dostat až do těsné blízkosti poškozeného místa a DNA co nejlépe opravit. Doposud ovšem nemáme jasnou představu o tom, jakým přesným způsobem v rostlinných buňkách k nápravě DNA dochází.
Cílem projektu Martiny Dvořáčkové bylo studovat chování chromatinu a opravných proteinů právě v místě poškození DNA. Pro svůj výzkum využívala klasický rostlinný modelový organismus huseníček rolní (Arabidopsis thaliana). Rostliny ovšem měly v buňkách nefunkční organizační proteiny, které vyřadila z provozu díky mutaci v genech pro histonový chaperon, který zodpovídá za jejich správné prostorové složení. „U buněk s chybnou funkcí histonových chaperonů dochází ke komplikacím například při dělení, protože v rostlinné DNA může díky nesprávnému uložení vznikat vice zlomů, což vede k nastartování opravných buněčných mechanismů,“ vysvětluje vědkyně.
Není mutant jako mutant
Špatnou organizací, a tedy i větší náchylností DNA k poškození, byly nejvíce zasažené specifické oblasti v genomu, kterým říkáme repetice. Jejich důležitou funkcí je například ochrana buněk před účinky různých chemikálií, na které byly mutované rostliny velmi citlivé. Ztrátu repetic u mutovaných rostlin pozorovala Martina Dvořáčková zejména v oblasti telomer, které se nachází na koncích chromozomů, a jejichž hlavní funkcí je jejich ochrana. Ke změnám docházelo také v oblastech repetic, které se nachází pod telomerami, a obsahují geny pro důležité proteiny označované jako ribozomy, které jsou zásadní pro správné fungovaní buněk, protože zajišťují veškerou syntézu proteinů. „Studovali jsme mutaci v histonovém chaperonu, která je unikátní v tom, že má velký dopad na strukturu chromozomu. Ovlivňuje délku telomer, která se zkrátila téměř na polovinu a rostliny přišly o 90 % ribozomálních genů, což nás velmi překvapilo,“ popisuje Dvořáčková veliký rozsah změn, které mutace způsobila.
Martina Dvořáčková ve svém výzkumu studovala dva různé mutanty. Oba měli poškozený gen pro histonový chaperon, ovšem jeden z nich na více místech v genomu. „Mutantní rostliny se připravují křížením a jejich příprava je časově velmi náročná. Jen vlastní příprava rostlinných mutantů nám zabrala asi rok a půl,“ přibližuje vědkyně náročný rozjezd projektu.
Čím víc mutací, tím odolnější rostliny
Výzkumnicí rostliny kvůli tomu, aby mohli studovat opravné mechanizmy, vystavili působení látky camptothecin, která poškozuje DNA a její účinek se kromě molekulárních změn projevil také na vzhledu rostlin. Huseníčky rostly na agarovém mediu, ze kterého získávaly prostřednictvím kořenů nízkomolekulární látky včetně camptothecinu. Vliv látky na růst rostlin pak probíhal nejen jednoduchým měřením různých parametrů, například délky kořene nebo množství biomasy v podobě suché hmotnosti rostliny, ale vědci využívali také složitějších molekulárně-biologických metod, díky kterým mohli zjistit například podíl poškozených buněk v kořínku.
Odpověď obou mutantů na působení škodlivé chemické látky byla velmi různá. U rostliny se zdvojenou chaperonovou mutací se totiž působení camptothecinu překvapivě neprojevilo na jejich vzhledu. „To pro nás bylo jedno z největších překvapení celého projetu,“ popisuje Martina Dvoříčková. „Znamená to, že se v necitlivých rostlinách chromatin lépe sestavil, což se odrazilo na přirozenějším vzhledu rostliny. Našli jsme molekulární dráhu, která ovlivňuje vzhled rostliny a přidanou mutací jsme ji dokázali potlačit.“
Na toto zjištění navázal výzkumný tým Martiny Dvořáčkové tím, že studoval, jak se v buňkách rostlin s jednoduchou mutací, které byly citlivé na působení camptothecinu, indukují opravné mechanizmy. Když je rostlina vystavena působení škodlivé látky, tak se ve zvýšené míře začnou přepisovat do RNA ty úseky DNA, které kódují opravné proteiny. A právě zvýšená hladina této RNA nám může napovědět, kdy a jak se tyto opravné mechanizmy v buňce aktivují. „Identifikovali jsme dva typy histonových chaperonů, které jsou klíčovou součástí drah, které zodpovídají za poškození rostlin. Zjistili jsme, že hladina RNA genů, které zajišťují opravy DNA, je vyšší u citlivých mutovaných rostlin a u necitlivých rostlin byla podobá jako u rostlin bez mutace,“ shrnuje vědkyně hlavní závěry výzkumného projektu.
Vývoj nových postupů je také důležitý
Molekulárně-biologických nástrojů, díky kterým můžeme studovat DNA v místě zlomu není mnoho, takže součástí projektu byl také vývoj nových postupů. Martina Dvořáčková a její tým poprvé v rostlinných buňkách použili metodu laserové iradiace, díky které v mikroskopu pomocí laseru a UV záření poškodili DNA v malé vybrané oblasti buněčného jádra. Proteiny, které se účastnili následných oprav, byly potom přitahovány do poškozeného místa a díky tomu mohli vědci studovat jejich dynamiku.
Jaké má vědkyně další plány do budoucna? „Budu se dále věnovat studiu oprav DNA v rostlinných buňkách. Společně s kolegy se snažíme pochopit vzájemné interakce reparačních proteinů, studujeme také další histonové chaperony a proteinové komplexy a to, jak se zapojují do udržování repetic DNA a jejích oprav,“ shrnuje Martina Dvořáčková své další vědecké plány.
