Výsledky interdisciplinárního výzkumného týmu vedeného prof. Vladimírem Havlíčkem z Mikrobiologického ústavu AV ČR v Praze naznačují, jak bychom mohli pomocí látek v moči nemocných jedinců včasně a neinvazivně diagnostikovat bakteriální nebo houbové infekce. Výzkum probíhal ve spolupráci s laboratořemi z řady českých nemocnic a podpořila jej Grantová agentura České republiky (GA ČR).
Bakteriální a houbové infekce významně přispívají ke globální nemocnosti a úmrtnosti. Zatímco některé oblasti medicíny zaznamenaly pokles řady infekčních nemocí, jiné čelí jejich rostoucímu výskytu, zejména v souvislosti s krizemi nebo stoupající antibiotickou rezistencí mikroorganismů. Aby byl snížen dopad infekčních onemocnění na veřejné zdraví, je nutné zlepšit infrastrukturu zdravotní péče a vyvinout výzkumné úsilí, které povede k včasné a přesné diagnostice a následně i účinnější léčbě infekčních onemocnění.
Cesta za lepší diagnostikou
Interdisciplinární řešitelský tým z Mikrobiologického ústavu AV ČR v Praze pod vedením prof. Vladimíra Havlíčka ukázal nové neinvazivní možnosti diagnostiky již časných stadií bakteriálních a houbových infekcí, a to zkoumáním látek, které se nachází v moči nemocných jedinců. Poměrně rizikový i finančně náročný výzkumný projekt započal v době prvních vln pandemie COVID-19 a navazoval na předběžné výsledky ze zvířecích modelů, které vědci získali v letech 2019-2021.
V rámci tohoto pilotního výzkumu pracoval vědecký tým s potkany infikovanými směsí infekcí. Na potkanech byly experimentálně vyzkoušeny analytické metody, zvláště hmotnostní spektrometrie s iontovou cyklotronovou rezonancí a různé druhy mikroskopií. Projekt ukázal, že látky s podobnou chemickou strukturou, které patogeny syntetizují v konkrétních stádiích vlastního buněčného dělení, se z místa zánětu dostávají do krevní cirkulace a poté jsou hostitelem vyloučeny do moče.
Zjištění následně výzkumníci aplikovali na lidskou populaci. Na souborech kriticky nemocných pacientů chtěli ukázat, zda je možné neinvazivně, včasně a specificky diagnostikovat časná stadia nejčastějších infekčních onemocnění bakteriálního a houbového původu. „Ukázali jsme, že zejména houbové siderofory — látky, které houby vylučují do okolí, — mohou být účinně ‚čištěny‘ pacientovými ledvinami a následně vyloučeny do jeho moče. Položili jsme tak základ nové diagnostické oblasti, kterou jsme nazvali infekční metalomika,“ říká Vladimír Havlíček, vedoucí Laboratoře charakterizace molekulární struktury.
Klíčoví pomocníci patogenů
V případě počínající infekce se mezi infikovaným hostitelem a mikrobiálním patogenem rozpoutá boj o živiny. Přetahovaná probíhá především o železo, zinek nebo měď. V souboji vyhrává lépe vybavený soupeř, tedy ten s početnějším a účinnějším arzenálem molekulárních nástrojů, které zajišťují střádání těchto nezbytných živin. Právě siderofory nebo metalofory pomáhají organismům dostatečný přísun živin zajistit a jsou syntetizovány nejen mikroby (zvláště bakterie, mykobakterie a vláknité houby), ale vyrábí si je také rostliny, paraziti nebo savci.
Savčí hostitel se probíhající infekci brání sekrecí lipokalinů – bílkovin, které některé mikrobiální siderofory vážou. Evolučně vyšlechtěné patogenní mikroorganismy dokážou svoje siderofory chemicky modifikovat, zvětšit jejich molekulární průměr, avšak se zachováním schopností vázat kovy. Těmto látkám říkáme „stealth“ siderofory. Nejúspěšnější patogeny pak vysílají falešné cíle (mock targets) nebo používají jiné inteligentní strategie pro zlepšení vlastní obrany vůči imunitnímu systému hostitele.
Odběrová místa lidských tělních tekutin výzkumníci analyzovali pomocí techniky kapalinové chromatografie a iontové cyklotronové rezonance.
Uvedení do praxe českými nemocnicemi
Výzkumníci ověřili svou pilotní hypotézu, tedy že mikrobiální siderofory jsou velmi specifickými značkami infekčních onemocnění, které se do okolí uvolňují ve fázi intenzivního buněčného dělení patogenu. Na základě přítomnost sideroforů v infikovaném hostiteli lze rozlišit pouhou kolonizaci od invazivního průběhu infekce, což je přínos, který doposavad používané diagnostické přístupy neposkytují.
Při porovnání nové metody se standardními technikami (molekulární techniky založené na DNA sekvenování, serologické a mikroskopické metody, kultivace) spolupracovali výzkumníci s jednotkami intenzivní péče v nemocnicích v Ostravě, Olomouci, Praze, Krnově a Havířově. Výsledky základního výzkumu byly natolik průkazné, že Agentura pro zdravotnický výzkum ČR udělila řešitelskému kolektivu grant aplikovaného výzkumu, díky němuž vědci započali multicentrickou klinickou studii, která na větším souboru pacientů prokáže umístění nové technologie mezi ustálenými standardními metodami.
Prof. Ing. Vladimír Havlíček, Dr.
Dr. Paulo De Souza Paioti z Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR vede prestižní projekt JUNIOR STAR, ve kterém zkoumá atropoizomery – molekuly s revolučním potenciálem pro vývoj léčiv. Se svým týmem vyvíjí inovativní metody syntézy, které umožní objevovat a vyrábět životně důležité léčivé látky udržitelnějším způsobem.
Přesnost molekulárních interakcí
Dr. Paiotiho, hlavního řešitele projektu, uchvátila chemie již během univerzitních studií, která mu otevřela vhled do spletitého pohybu molekul a jejich vlivu na vlastnosti látek. „Velká část krásy chemie pochází z pochopení toho, jak molekuly interagují na molekulární úrovni a jak to ovlivňuje vlastnosti, které lze skutečně vidět nebo nahmatat,“ vysvětluje počáteční impuls jeho celoživotní záliby v chemii Paulo Paioti. Obzvláště ho zaujal vinkristin, strukturálně komplexní organická molekula, která se po vstupu do lidského těla cíleně zaměřuje na likvidaci rakovinových buněk. Tento příklad ilustruje vysokou přesnost molekulárních interakcí.
Atropoizomery: klíč k udržitelnému vývoji léčiv?
Dr. Paioti a jeho tým se ve svém projektu JUNIOR STAR zaměřují na atropoizomery – třídu molekul s významným potenciálem farmaceutického využití. Přesněji řečeno, jejich cílem je vyvinout nové metody syntézy těchto molekul, které by byly environmentálně šetrnější. „Atropoizomery mají zásadní význam pro budoucnost vývoje léčiv. Naše práce si klade za cíl rozšířit repertoár dostupných sloučenin, což by mohlo vést k převratným způsobům léčby různých onemocnění,“ vysvětluje vědec.
Pokud bude projekt doktora Paiotiho úspěšný, mohl by mít zásadní dopad na zdraví i udržitelnost. „V dlouhodobém horizontu může projekt vést k novým léčivům, která mohou pomoci proti smrtelným chorobám, jako je rakovina,“ poznamenává. Kromě toho by výzkum mohl být průkopníkem ekologicky udržitelnějších chemických procesů. V rámci projektu totiž vědecký tým také například zkoumá chemické reakce, ve kterých by místo běžně používaného palladia plnil funkci katalyzátoru nikl, který je mnohem méně toxický a v přírodě častější, tudíž i levnější. „Doufáme, že se nám podaří díky využití niklu vytvořit udržitelnější a dostupnější metody výroby životně důležitých léčiv,“ dodává původem brazilský vědec.
Nezbytnost mezinárodní spolupráce
Hlavní řešitel projektu, jak sám říká, věří, že „věda by neměla mít hranice“. Po studiu chemie v Brazílii, absolvování doktorátu v USA a následném postdoktorátu ve Francii, ho kariérní cesta zavedla do Česka. Po všech těchto zkušenostech si hluboce cení rozmanitých perspektiv, které přináší multikulturní tým. Jeho současná skupina zahrnuje členy pěti různých národností. „Projekt bude skutečně úspěšný pouze tehdy, pokud budeme spolupracovat s výzkumníky ze zahraničí i odsud,“ zdůrazňuje nezbytnost globální spolupráce pro vědecký úspěch a pokrok.
Dr. Paioti (vlevo nahoře) se svým týmem
Když se utvářela molekulární podstata života, nechybělo málo a mohlo dojít k fatálnímu pomatení jazyků jeho základních tvůrců. V takovém případě by žádný život možná ani nevznikl, tedy určitě ne ve formě, jakou známe dnes. Molekulární řečí buněk se po mnoho let zabývají čeští molekulární biologové z Mikrobiologického ústavu Akademie věd ČR pod vedením Dr. Leoše Valáška. Jejich výsledky na toto téma, podporované Grantovou agenturou ČR (GA ČR), nedávno otiskly prestižní odborné časopisy, jako je Nature a Nature Structural and Molecular Biology.
Chceme-li porozumět člověku, který mluví cizím jazykem, máme dvě možnosti. Buď si zaplatíme profesionálního překladatele, nebo se jeho jazyk pokusíme naučit gramatickým rychlokurzem a překladatelem „rychlokvaškou“ se staneme sami. V takovém případě se naše překladatelské schopnosti neobejdou bez výkladového slovníku. Takových překladatelů „rychlokvašek“ má každá buňka přehršel. Už odedávna se starají o to, aby genetickou informaci uloženou v řeči DNA (nukleotidové sekvenci DNA) přesně přeložili do řeči bílkovin (aminokyselinové sekvence). Díky tomu totiž buňka, potažmo celý organismus, žije a množí se. Bez dokonalých slovníků jsou však tito neviditelní překladatelé zcela ztracení. Ale jsou jejich slovníky dokonalé?
„Nukleotidština“ a „aminokyselinština“ jako dva základní jazyky života
Genetická informace je uložena v molekulách DNA. Jednotlivé úseky DNA označujeme jako geny a soubor genů v daném organismu nazýváme genom. Každá molekula DNA se skládá ze čtyř základních stavebních prvků – nukleotidů. V přeneseném slova smyslu lze říci, že různými kombinacemi nukleotidů vznikají jednotlivá slova a věty řeči DNA, tedy „nukleotidštiny“. Genom si pak lze představit jako knihu života. Každé slovo je tvořeno kombinací přesně tří nukleotidů, takže tato molekulární řeč má pouze 64 slov, respektive 61 slov a 3 různé druhy teček, které věty ukončují. V porovnání s naší řečí je „nukleotidština“ vskutku na slovo skoupá.
Každý gen je ukončený tečkou a obsahuje návod na výrobu jedné bílkoviny, tedy řetězce aminokyselin, která vzniká různými kombinacemi dvaceti základních aminokyselin procesem zvaným proteinová syntéza. Opět lze v nadsázce říci, že různými kombinacemi aminokyselin vznikají jednotlivá slova a věty řeči bílkovin, tedy „aminokyselinštiny“.
Rychlokvaška ribozom se slovníky tRNA
Definici života tak lze vyjádřit jako dokonale provedený překlad genetické informace z „nukleotidštiny“ do „aminokyselinštiny“, který v každé buňce probíhá prakticky neustále od jejího zrození až po její skon. O něj se stará makromolekula zvaná ribozom. Je to ale ten typ překladatele, který si bez slovníku vůbec neví rady. Jako slovníky mu slouží malé molekuly zvané transferové RNA (tRNA), které přenáší aminokyseliny. Opět v nadsázce řečeno, ribozom otevře jednu stránku knihy DNA, kde je v „nukleotidštině“ napsáno, v jakém přesném pořadí je třeba ze všech dostupných dvaceti aminokyselin vyrobit bílkovinu, kterou si buňka zrovna potřebuje vyrobit.
Molekuly tRNA umí každé slovo z celkových 61 přečíst, protože jsou stejně jako DNA tvořeny sekvencí nukleotidů, a podle smyslu a pořadí těchto slov na ribozom postupně přinesou přesně ty aminokyseliny, které daným slovům odpovídají. To je přesně určeno tzv. genetickým kódem. Ribozom se pak stará o to, aby se jednotlivé aminokyseliny propojily do celé smysluplné věty „aminokyselinštiny“, tedy vytvořily požadovanou bílkovinu. Při 61 slovech „nukleotidštiny“ a 20 slovech „aminokyselinštiny“ je patrno, že se některá slova „nukleotidštiny“ musejí překládat stejnou aminokyselinou. Tak to opravdu je, a proto se genetickému kódu říká, že je degenerovaný. V tomto případě je ale degenerace ke prospěchu věci.
tRNA poplety
Je známo, že slovníky tRNA nejsou neomylné. Občas se význam některých slov „nukleotidštiny“ poplete a tRNA přinese na ribozom jinou aminokyselinu, než jaká danému slovu odpovídá. Děje se tak naštěstí jen opravdu velmi zřídka. O něco častěji se ale může stát, že tRNA přinesou na ribozom aminokyselinu i v okamžiku, kdy „nukleotidština“ signalizuje jednu ze tří teček a mělo by dojít k ukončení syntézy dané bílkoviny. V takovém případě se syntéza některých bílkovin protáhne a ty jsou potom delší, než by správně měly být. Někdy je to žádoucí, ale většinou jsou takto prodloužené bílkoviny buňkou ihned zlikvidovány. Zajímavé je, že jen hrstka molekul tRNA dělá tyhle chyby, zatímco většina ostatních je vskutku neomylná a čte/kóduje jen tu svoji aminokyselinu. Vědci z Mikrobiologického ústavu AV ČR chtěli zjistit, které z molekul tRNA patří mezi tyhle „tRNA poplety“ a také, proč tomu tak je.
Dr. Valášek a jeho vědecký tým
Nonstop trypanosoma a tRNA-superpopleta.
Vědci z Ostravské univerzity pod vedením prof. Marka Eliáše se v nedávné době podíleli na objevu velmi zajímavého fenoménu: popsali organismy, jejichž věty jsou v „nukleotidštině“ přerušeny velkým množstvím teček. V principu by vůbec neměly přežít, protože dle pravidel daných genetickým kódem by syntéza prakticky všech jejich proteinů měla být předčasně ukončena. Oni ale bez problému kolonizovali celý svět. Patří mezi ně například trypanosomy Blastocrithidia nonstop.
Dílem náhody se týmu Leoše Valáška, ve spolupráci s vědci z Parazitologického ústavu Biologického centra AV ČR pod vedením prof. Juliuse Lukeše a Dr. Zdeňka Parise, podařilo ukázat, že jedním z hlavních důvodů, proč tyto organismy přežily, je fakt, že mají speciální tRNA kódující aminokyselinu tryptofan, která je superpopleta. Tato tRNA čte jednu ze tří teček právě jako tryptofan a úplně ignoruje, že tečka, ať je uprostřed věty, nebo na jejím konci, by měla vždy znamenat konec. Tento objev byl v roce 2023 zveřejněn v prestižním časopise Nature.
Rozhoduje síla vazby
Laboratoř Leoše Valáška se již několik let zabývala otázkou, jak a proč se mezi tRNA vyskytují tyhle tRNA poplety. Nedávno se výzkumnému týmu podařilo ukázat, že tRNA poplety se od těch přesných liší jen v drobných detailech v jejich celkovém složení. Tyto malé rozdíly pak registruje ribozom, se kterým si díky těmto odlišnostem vytvoří silnější intermolekulární vazbu. Jinými slovy, díky této vylepšené vazbě je ribozom neodmítne, a to ani když tečky (tj. konce vět) nelogicky překládají jako aminokyseliny tryptofan, popřípadě glutamin. Odborně se tomu říká pročítání stop kodónu, které vede k produkci nestandardně dlouhých proteinů. Tento objev byl nedávno zveřejněn v prestižním časopise Nature Structural and Molecular Biology.
Jak využít omylné tRNA slovníky?
Existuje celá řada více či méně vzácných genetických onemocnění, jejichž podstata spočívá ve spontánním výskytu jediné tečky navíc někde uprostřed jedné jediné věty v rámci celého genomu. Této „tečce navíc“ se říká nesmyslná mutace a tato věta vždy kóduje nějaký pro buňku velmi důležitý protein. Mezi nejznámější onemocnění tohoto typu patří cystická fibróza, která je způsobená jednou nesmyslnou mutací v genu, jehož proteinový produkt zajišťuje čistotu a dobrou funkci plic.
Pokud by se vědcům podařilo zpřesnit funkci těch pár známých popletených tRNA, tak bychom se v budoucnu mohli dočkat tzv. tRNA terapií. V rámci nich do těla pacientů vneseme tyto modifikované tRNA, které zajistí, že jakákoliv tečka uprostřed jakékoliv věty bude bezpečně přečtena, syntéza zkráceného proteinu bude dokončena a pacient bude jednou provždy vyléčen.
Nebude to jednoduché, neboť je současně naprosto nezbytné, aby tečky na konci všech „genomických“ vět zůstaly dál tečkami. Jinými slovy, tyhle pravé tečky musí zdokonalené, popletené tRNA zcela ignorovat. Naštěstí se dle současného výzkumu, včetně toho z Laboratoře regulace genové exprese Leoše Valáška, zdá, že pokrok v téhle oblasti je mnohem rychlejší a nadějnější, než si vědci ještě do nedávna dokázali vůbec představit.
Nikdo není dokonalý… a toho se dá využít!
Ani naše základní molekulární mechanismy nejsou zcela dokonalé. A tak díky rychlokvašce překladateli-ribozomu a popleteným tRNA máme šanci si sami opravit nesmyslné mutace v knihách/genomech našich životů, které velmi snižují kvalitu života některých pacientů a které se dědičnými stávají proto, že je základní opravné mechanismy buňky nedokázaly opravit anebo opravit nestihly. Překlad z „nukleotidštiny“ do „aminokyselinštiny“ upravený člověkem zvnějšku zřejmě nebyl nikdy blíže jeho uplatnění v medicíně, než je nyní.
Dr. Leoš Valášek
Autorství textu: Dr. rer. nat. Leoš Valášek, DSc.
